Caracterización

Caracterización nutricional y perfil fenólico de las hojas de moringa oleífera cultivadas en Chad, en los campos de refugiados saharauis y en Haití.

Leone A 1, 2 , Fiorillo G 3, 4 , Criscuoli F 3, 4 , Ravasenghi S 3, 4 , Santagostini L 5 , Fico G 6, 7 , Spadafranca A 3, 4 , Battezzati A 3, 4 , Schiraldi A 4 , Pozzi F 8 , di Lello S 9 , Filippini S 10 , Bertoli S 3, 4 .

Información del autor

1
Centro Internacional para la Evaluación del Estado Nutricional (ICANS), Universidad de Milán, Via Sandro Botticelli 21, 20133 Milán, Italia. alessandro.leone1@unimi.it.
2
Departamento de Alimentos, Ciencias Ambientales y Nutricionales (DeFENS), Universidad de Milán, Via Celoria 2, 20133 Milán, Italia. alessandro.leone1@unimi.it.
3
Centro Internacional para la Evaluación del Estado Nutricional (ICANS), Universidad de Milán, Via Sandro Botticelli 21, 20133 Milán, Italia. alberto.schiraldi@unimi.it.
4
Departamento de Alimentos, Ciencias Ambientales y Nutricionales (DeFENS), Universidad de Milán, Via Celoria 2, 20133 Milán, Italia. alberto.schiraldi@unimi.it.
5
Departamento de Química, Universidad de Milán, Via Golgi 19, 20133 Milán, Italia. laura.santagostini@unimi.it.
6
Departamento de Ciencias Farmacéuticas (DISFARM), Universidad de Milán, Via Mangiagalli 25, 20133 Milán, Italia. gelsomina.fico@unimi.it.
7
Jardín Botánico GE Ghirardi, Departamento de Ciencias Farmacéuticas (DISFARM), Universidad de Milán, Via Religione 25, 25088 Toscolano Maderno, Italia. gelsomina.fico@unimi.it.
8
Fundación AVSI, Via Legnone, 20158 Milán, Italia. federica.pozzi@avsi.org.
9
Movimento Africa 70, Via Missori 14, 20900 Monza, Italia. sara.dilello@alice.it.
10
Fundación ACRA, Via Lazzaretto 3, 20124 Milán, Italia. sandro.filippini@acra.it.

1. Introducción

Moringa oleifera lam. Es una planta perteneciente al género monogénico Moringa de la familia Moringaceae. Es nativo del subcontinente indio, pero gracias a su capacidad de crecer tanto en tierras húmedas como secas, y sobrevivir en suelos menos fértiles afectados crónicamente por la sequía, se ha naturalizado en áreas tropicales y subtropicales de todo el mundo [  ]. Se ha definido como un árbol de usos múltiples, ya que todas las partes de la planta se utilizan para diferentes propósitos. Las hojas son la parte más utilizada de la planta. En particular, se utilizan para la nutrición humana y animal y en la medicina tradicional para el tratamiento de muchas enfermedades [  ]. Varios in vitro e in vivolos estudios, de hecho, han atribuido numerosas propiedades farmacológicas a las hojas de M. oleifera , aunque la evidencia científica sobre los seres humanos todavía es limitada [  ]. Las hojas también se pueden usar como potenciador natural del crecimiento de las plantas y como biopesticida [  ].

Las hojas son ricas en proteínas, calcio, hierro, potasio, vitaminas (particularmente C y E), β-caroteno [  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ], y en compuestos antioxidantes y bioactivos, como los flavonoides, Ácidos fenólicos, glucosinolatos e isotiocanatos, taninos y saponinas [  ,  ], primer responsable de las numerosas propiedades farmacológicas atribuidas a las hojas de M. oleifera [  ]. Estas características hacen que la planta sea adecuada para ser utilizada en la lucha contra la desnutrición y como planta medicinal en países subdesarrollados y en desarrollo.

Aunque varios estudios mundiales informan las características nutricionales y el contenido fenólico total de las hojas de M. oleifera , pocos estudios han investigado su perfil fenólico [  ,  ]. Además, estos hallazgos son a menudo controvertidos. Varios factores, como las diferentes condiciones agroclimáticas existentes entre los países donde crece la planta, los factores genéticos, las diferentes técnicas de cultivo y el método de secado utilizado [  ,  ,  ,  ], pueden afectar el contenido de nutrientes y Compuestos fenólicos. Forster et al. ] sugieren que debido a una enorme sugestibilidad de metabolitos secundarios por el medio ambiente, los hallazgos deben probarse en ensayos de campo en áreas de cultivo de M. oleifera.

Por último, el contenido de algunos compuestos con actividad farmacológica documentada, como los ácidos salicílico y ferúlico [  ,  ,  ,  ], ha sido poco investigado hasta el momento. El ácido salicílico se conoce principalmente como el principal metabolito y componente activo de la aspirina, un fármaco antiinflamatorio, y parece estar involucrado en la prevención de algunos tipos de cáncer [  ]. El ácido ferúlico posee diversas propiedades fisiológicas, como la inhibición de la promoción de tumores, la reducción de los perfiles séricos y de lípidos hepáticos (principalmente el colesterol total), la reducción del nivel de triglicéridos y una acción protectora contra la lesión hepática [  ]. Sin embargo, su contenido en M. oleifera. Las hojas han sido poco investigadas hasta el momento.

En este artículo, hemos realizado una caracterización nutricional y un perfil fenólico de las hojas de M. oleifera recolectadas en Haití, Chad y el suroeste de Argelia, donde los campos de refugiados saharauis se ubicaron desde 1975; tres áreas en las que la población local utiliza hojas de M. oleifera , pero cuyas características nutricionales y perfil fenólico no están disponibles. Estos tres países dependen parcial o totalmente de la ayuda humanitaria para el suministro de alimentos y medicamentos. El uso de M. oleifera.Los cultivos locales, tanto con fines nutricionales como farmacológicos, podrían otorgar a estos países una mayor independencia de la ayuda humanitaria. Sin embargo, a la luz de consideraciones previas sobre los efectos de varios factores que afectan la composición de las hojas, antes de usar las hojas de M. oleifera con fines nutricionales y farmacológicos, es necesario realizar una caracterización de las hojas. El tercer y último objetivo del presente estudio fue investigar la presencia de ácidos salicílicos y ferúlicos en las hojas de M. oleifera .

2. Resultados y discusión.

En primer lugar, realizamos una caracterización nutricional de las hojas recolectadas en diferentes países ( Tabla 1 ). Se encontraron humedades residuales de 7.3 ± 0.5, 6.0 ± 0.2, y 8.8 ± 0.1 g / 100 g en las hojas recolectadas en Chad, campos saharauis y Haití, respectivamente. Como era de esperar, las hojas presentaron un alto contenido de proteína cruda. Las hojas haitianas fueron las más pobres en proteínas, pero se encontraron cantidades similares en las hojas recolectadas en México, Níger y Tailandia [  ,  ,  ]. El contenido de grasa bruta fue moderado, de acuerdo con algunos estudios previos [  ,  ,  ], pero más bajo [  ,  ] o más alto [ ] que la encontrada por otros estudios. El contenido de fibra fue muy alto, especialmente en la fracción insoluble. Las hojas haitianas fueron las más ricas en fibra. Estas cantidades son similares al contenido de fibra de las hojas de M. oleifera recolectadas en México [  ], pero mayores que las cantidades encontradas en las hojas recolectadas en otros países [  ,  ]. El contenido de azúcar fue muy diferente entre las muestras. El contenido de sacarosa fue mayor en las hojas recolectadas en los campos saharauis, mientras que las hojas recolectadas en Haití fueron las más ricas en glucosa y fructosa. Se encontró que la maltosa no era detectable en todas las muestras. Este es el primer informe en el que se ha investigado el contenido de azúcar. M. oleiferaLas hojas son una buena fuente de minerales dietéticos. Los minerales predominantes en las hojas fueron el calcio y el magnesio. Las hojas recolectadas en los campos saharauis fueron las más ricas en calcio, hierro, sodio y cobre, mientras que los contenidos de magnesio y zinc fueron similares entre las muestras. Los contenidos minerales reportados en la literatura son muy diferentes. El contenido de calcio en el estudio actual estuvo dentro del rango informado en la literatura [  ,  ,  ,  ,  ,  ]. En nuestras muestras, el contenido de magnesio fue similar a las cantidades encontradas en las hojas recolectadas en Sudáfrica [  ] y Ghana [  , ], pero más de cinco veces más que las cantidades encontradas en las hojas recolectadas en Pakistán [  ]. El contenido de sodio encontrado en las hojas recolectadas en Haití y Chad fue similar a las cantidades reportadas por algunos estudios previos [  ,  ], mientras que el contenido de sodio encontrado en las hojas recolectadas en los campos saharauis fue el mayor. Cabe señalar que otros estudios encontraron cantidades más bajas [  ] o no detectables [  ] de sodio en las hojas de otros países. El contenido de hierro encontrado en las hojas recolectadas en los campos saharauis estaba de acuerdo con las cantidades encontradas en las hojas recolectadas en algunas provincias de Pakistán y Tailandia [  , ], mientras que el contenido de hierro de las hojas recolectadas en Haití y Chad fue de tres a cuatro veces menor. Finalmente, las cantidades de zinc y cobre encontradas en nuestras muestras coincidieron con las investigaciones anteriores [  ,  ].

tabla 1

La caracterización nutricional de M. oleifera parte de Chad, los campos de refugiados saharauis (Southwester Algeria) y Haití, expresados como materia seca.

Nutrientes   CHAD CAMPOS DE SAHRAWI HAITÍ
Media ± sd Media ± sd Media ± sd
Proteínas g / 100 g 31.47 ± 0.12 27.98 ± 0.12 20,80 ± 0,01
Lípidos g / 100 g 6.65 ± 0.28 4,85 ± 0,30 7.05 ± 0.11
Fibra total g / 100 g 33.29 ± 0.63 31.88 ± 0.34 37.63 ± 1.00
Fibra insoluble g / 100 g 23.97 ± 0.46 27.94 ± 0.27 30.09 ± 1.40
Fibra soluble g / 100 g 9.31 ± 0.18 3.94 ± 0.07 7.54 ± 0.40
Almidón ( estimado por diferencia ) g / 100 g 12.41 ± 0.52 11.37 ± 0.06 13.75 ± 0.31
Glucosa g / 100 g 2,41 ± 0,20 2.03 ± 0.17 4,57 ± 0,16
Fructosa g / 100 g 0.47 ± 0.07 0,54 ± 0,04 4.81 ± 0.31
Sacarosa g / 100 g 2.50 ± 0.08 7.96 ± 0.00 1.77 ± 0.08
Maltosa g / 100 g DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE
despojos mortales g / 100 g 10.79 ± 0.01 13.38 ± 0.05 9.62 ± 0.02
Sodio mg / 100 g 307.65 ± 1.49 791.28 ± 4.43 262.50 ± 5.45
Calcio mg / 100 g 1839.10 ± 12.82 2743.38 ± 39.69 2150.26 ± 56.07
Planchar mg / 100 g 17,03 ± 0,79 41.68 ± 1.08 11,91 ± 0,82
Zinc mg / 100 g 2.48 ± 0.01 3.09 ± 0.01 2.18 ± 0.06
Magnesio mg / 100 g 562.49 ± 9.07 489.94 ± 8.76 533.51 ± 23.87
Cobre mg / 100 g DAKOTA DEL NORTE 1.22 ± 0.08 0.66 ± 0.00
Fitatos g / 100 g 2.95 ± 0.02 3.03 ± 0.15 2.55 ± 0.19
β-caroteno mg / 100 g 19.03 ± 0.19 28.53 ± 1.71 10.01 ± 0.07

Abreviatura: ND = no detectable.

Aunque el contenido mineral de las hojas de M. oleifera fue alto, el contenido de fitato fue igualmente alto. Las cantidades encontradas en las hojas están de acuerdo con investigaciones anteriores [  ,  ,  ] y son mayores que las encontradas en leguminosas y cereales [  ], pero ligeramente más bajas en comparación con las cantidades encontradas en el salvado de trigo [  ]. Desafortunadamente, estos compuestos son capaces de unir minerales, por lo que no están disponibles para la absorción intestinal. Se recomiendan investigaciones futuras dirigidas a identificar formas de reducir el contenido de fitato de las hojas de M. oleifera . Se encontraron hojas ricas en β-caroteno, más que naranja, zanahorias y melón, las principales fuentes vegetales de este compuesto [ ]. Las hojas recolectadas en los campos saharauis fueron las más ricas en β-caroteno. Las cantidades encontradas en las hojas recolectadas en Chad y en los campamentos saharauis fueron similares a la cantidad encontrada en las hojas recolectadas en Sudáfrica [  ], pero menores en comparación con las cantidades encontradas en India [  ], mientras que el contenido de β-caroteno del Las hojas recolectadas en Haití fueron inferiores a las cantidades reportadas en la literatura [  ].

En segundo lugar, evaluamos la actividad antioxidante total de las hojas y determinamos su contenido de polifenoles totales y ácidos salicílicos y ferúlicos ( Tabla 2 ). Además, realizamos un análisis LC-MS del extracto metanólico de la hoja para proporcionar una imagen de los compuestos fenólicos presentes en las plantas cultivadas en estos tres países.

Tabla 2

Contenido de compuestos bioactivos de hojas de M. oleifera cultivadas en Chad, campos de refugiados saharauis (sudoeste de Argelia) y Haití, expresados como materia seca.

Compuestos   CHAD CAMPOS DE SAHRAWI HAITÍ
Media ± sd Media ± sd Media ± sd
TEAC µmol trolox / g 304.63 ± 8.70 427.16 ± 33.94 335.61 ± 7.37
Polifenoles totales mg / 100 g 2813 ± 51 3552 ± 388 2545 ± 194
Ácido salicílico mg / 100 g 0.14 ± 0.02 0.20 ± 0.01 0.33 ± 0.04
Ácido ferúlico mg / 100 g 6.61 ± 0.15 8.86 ± 0.18 9.69 ± 0.26

Las hojas de M. oleifera presentaron una alta capacidad antioxidante total, en consecuencia a un alto contenido de polifenoles totales. En particular, las hojas recolectadas en los campos saharauis presentaron la actividad antioxidante total más alta y se encontraron con los polifenoles totales más ricos, mientras que las hojas recolectadas en Chad y Haití fueron similares entre sí. La actividad antioxidante total encontrada en nuestra muestra fue, sin embargo, más baja que la reportada por Pari et al.  ]. Por otro lado, el contenido total de polifenoles estaba de acuerdo con algunas investigaciones previas [  ,  ,  ], pero inferiores a las cantidades informadas por otras [  ,  ].

En la Figura 1 se muestra el cromatograma de HPLC-UV de los extractos metanólicos de hojas de M. oleifera recolectadas en los tres países. Como era de esperar, los flavonoides fueron los principales compuestos fenólicos. Quercetina-3- O- glucósido (compuesto 10 ), quercetina-3- O - (6 '' - malonil) glucósido (compuesto 11 ), quercetina-3 O - (X '' - malonil) glucósido (compuesto 12 ), kaempferol-3- O glucósido (compuesto 13 ), y kaempferol-3- O -malonylglucoside (compuesto 14 ) se identificaron en todas las muestras de acuerdo con informes anteriores [  , ,  ]. Además, hemos atribuido los picos en aproximadamente 17.42 (17.49), 26.13 (26.65) y 35.56 (35.67) min respectivamente a un flavonoide glicosilado derivado de la condensación de kaempferol con una ramnosa y una glucosa (compuesto 6 ), quercetina-3- O - glucósido -7- O- ramnosido (compuesto 8 ) y metil- O -quercetina-malonilglucósido (compuesto 15 ). Es interesante que las hojas recolectadas en Chad y los campos de refugiados saharauis se caracterizaron por un isorhamnetin-rhamnosyl-glucoside (13.0 min) (compuesto 5).) y un diglucósido, probablemente compuesto por quercetina y dos unidades de ramnosa, o por kaempferol condensado en un ramnosil-glucósido (compuesto 4 ). Este estudio también confirma la presencia de apigenina- C -glucósido [  ] (compuesto 7 ) y agrega que la apigenina- O- glucósido (compuesto 9 ) también está presente. Sobre la base de los espectros ESI (+) - MS y UV-VIS, además de los flavonoides en todos los extractos, el pico a aproximadamente 6.98–7.6 min se identificó como hexadecilferulado (compuesto 3 ). Además, atribuimos otros compuestos, en los cuales la presencia en M. oleifera.hojas aún no fue reportado. En las hojas recolectadas en los campamentos de Chad y Saharaui, el compuesto que se eluye a 2.56 minutos (2.80 minutos en la muestra saharaui) se identificó como glucósido del ácido 5-hidroxiferúlico (compuesto 1 ), un precursor del ácido sináptico, mientras que el pico es de aproximadamente 6.31 minutos ( 5.67 min en Sahrawi) se atribuyó a la diferuloyil- (5OH-feruloyl) espermidina (compuesto 2 ). A diferencia del extracto metanólico de las hojas haitianas de M. oleifera , los compuestos eluidos en el rango de 3.84 a 6.08 y respectivamente a los 9.37 y 18.41 minutos se identificaron como glucosinolatos (compuestos 16 ), dicoumoyl putrescine (compuesto 17 ) y di (dihydrocaffeoyl) spermidine (compuesto 18 ), otros dos alcaloides de poliamina.

Un archivo externo que contiene una imagen, una ilustración, etc. El nombre del objeto es ijms-16-18923-g001.jpg

Cromatograma de HPLC de extractos metanólicos de hojas de M. oleifera recolectados en Chad ( A ); Campamentos saharauis ( B ); y Haití ( C ).

Finalmente, todas nuestras muestras presentaron cantidades detectables de ácidos salicílicos y ferúlicos. Las hojas recolectadas en Haití fueron las más ricas en ácidos tanto salicílicos como ferúlicos. Este es el primer estudio que informa la presencia de ácido salicílico en hojas de M. oleifera . La concentración de ácido salicílico encontrada en las hojas de M. oleifera fue comparable con las cantidades presentadas en nectarina, piña, tomate y espárragos, pero más alta que las cantidades encontradas en otras frutas y verduras [  ]. Sólo las especias presentan una concentración de ácido salicílico 10 veces superior [  ]. Del mismo modo, las cantidades de ácido ferúlico encontradas en M. oleifera.Las hojas fueron comparables con las cantidades encontradas en varias frutas y verduras, como la naranja, la berenjena, la espinaca, el repollo rojo y el maní, pero fueron mucho más bajas que las cantidades encontradas en los cereales [  ].

Como se esperaba, las hojas recolectadas en estos tres países presentaron diferencias tanto en la composición nutricional como en el contenido fenólico cuantitativo, como consecuencia de diferentes condiciones ambientales, factores genéticos, cultivo y técnicas de secado. Forster et al.  ] reportan alta variabilidad de ecotipos en el contenido de metabolitos secundarios en hojas de M. oleifera . Además, los autores observaron que la deficiencia de agua determinó un incremento en la producción de compuestos fenólicos. El estrés hídrico, de hecho, determinó un aumento del estrés oxidativo que las plantas contraatacan, aumentando la producción de compuestos antioxidantes [ ]. Además, el estrés hídrico también determina un incremento del estrés osmótico que las plantas contraatacan, incrementando la acumulación de prolina, sacarosa e iones (K + , Na + y Cl - ) [  ]. La deficiencia de agua podría ser una de las razones por las cuales las hojas recolectadas en los campos saharauis presentan una caracterización nutricional diferente y una capacidad antioxidante total diferente. Los campos de refugiados saharauis, de hecho, están ubicados en el suroeste de Argelia, en el desierto del Sahara, donde la disponibilidad de agua es muy baja. Sin embargo, no podemos excluir la existencia de diferentes ecotipos de M. oleifera.en estos tres países, especialmente entre los países africanos y Haití. Definitivamente, estos hallazgos, de acuerdo con otros autores, refuerzan la necesidad de conocer las características nutricionales y fenólicas de las hojas de M. oleifera cultivadas localmente antes de usarlas con fines nutricionales y farmacológicos.

Independientemente de las diferencias encontradas en las hojas de M. oleifera recolectadas en diferentes países, estos hallazgos son de particular relevancia para las poblaciones subsaharianas y caribeñas, que sufren desnutrición. Los últimos informes muestran una alta prevalencia de desnutrición, especialmente entre los niños, en estas tres áreas. Específicamente, la prevalencia de retraso del crecimiento, pérdida y bajo peso es de 39%, 16% y 30% en Chad [  ], 29.1%, 9.1% y 18.6% en los campos de refugiados saharauis [  ] y 22.2%, 4.3 %, y 10.5% en Haití [ ]. Las principales causas de la malnutrición infantil en estos países incluyen la mala nutrición materna, las malas prácticas de higiene, las malas prácticas de alimentación y la calidad de los alimentos, que conducen a una deficiencia de nutrientes esenciales. La principal deficiencia de nutrientes concierne a las proteínas, la vitamina A, el hierro, el zinc, el calcio y otros micronutrientes [  ]. Las hojas de M. oleifera , gracias a su alto contenido de proteínas y aminoácidos esenciales (44%) [  ], minerales y contenido de β-caroteno, podrían representar una fuente económica de todos estos nutrientes. Además, gracias a su contribución en compuestos bioactivos (flavonoides y ácidos fenólicos, entre los que se encuentran los ácidos salicílico y ferúlico), M. oleifera.las hojas podrían compensar la baja ingesta de compuestos fenólicos debido al escaso consumo de frutas y verduras observado en estas poblaciones [  ] y ser objeto de una posible explotación en los países occidentales como ingredientes nutracéuticos y funcionales.

Se debe prestar especial atención a los efectos de la cocción. Las hojas de M. oleifera se pueden comer crudas, pero, en general, se comen cocidas, se agregan a las preparaciones de alimentos locales o para preparar decocciones [  ]. Desafortunadamente, cocinar puede causar un agotamiento de nutrientes y compuestos bioactivos. La magnitud de las pérdidas depende de la temperatura y la duración del tratamiento. Por lo tanto, para evitar la pérdida excesiva de nutrientes y compuestos bioactivos, las hojas de M. oleiferaPuede añadirse al final de la cocción o en preparaciones ya cocinadas. La investigación futura dirigida a medir las pérdidas nutricionales y fenólicas causadas por la cocción será útil para determinar la magnitud de tales pérdidas y llenará esta falta de información. Finalmente, las futuras intervenciones dietéticas, destinadas a incluir las hojas de M. oleifera como un suplemento nutricional, deben tener en cuenta las pérdidas causadas por la cocción.

3. Sección experimental.

3.1. Muestras

Se recolectaron hojas frescas de diferentes plantas de M. oleifera.creció espontáneamente en Chad, en los campos de refugiados saharauis y en Haití. Se recogieron muestras de Chad en el valle de Logone, en el sur del país, junto a la frontera con Camerún. Se recogieron muestras de los campamentos de refugiados saharauis en la provincia de Tindouf, en el suroeste de Argelia, junto a la frontera con Marruecos. Finalmente, se recolectaron muestras de Haití en el área alrededor de Puerto Príncipe. Las plantas han sido identificadas por el Dr. Alberto Spada, profesor asistente de Botánica en la Universidad de Milán. La recolección se llevó a cabo entre marzo de 2011 y noviembre de 2012. Después de la recolección, las hojas se secaron a temperatura ambiente y se empaquetaron 200 g de cada muestra seca y se enviaron a nuestro laboratorio. Al llegar, las hojas secas se trituraron hasta obtener un polvo fino con un molinillo eléctrico y se almacenaron a -80 ° C.

El análisis de proximidad, la capacidad antioxidante equivalente de trolox (TEAC), los fenoles totales y los contenidos de SA y FA y el perfil fenólico se determinaron experimentalmente. Todos los análisis fueron realizados por triplicado por los mismos operadores.

3.2. Productos quimicos

Hidróxido de sodio, sulfato de sodio anhidro, glucosa, fructosa, sacarosa, ABTS, persulfato de potasio, α-amilasa, amiloglucosidasa, proteasa, etanol, cloruro de hierro (III) hexahidrato, ácido sulfosalicílico y trolox se compraron de Sigma-Aldrich (St. Louis , MO, EE. UU.). Ácido bórico, indicador mixto para las valoraciones de amoníaco, reactivo de Folin-Ciocalteu, carbonato de sodio, tetrahidrofurano, metanol, diclorometano, cloruro de sodio, fosfato de sodio monobásico anhidro, fosfato de disodio, ácido clorhídrico, ácido fórmico, éter de petróleo, acetonitrilo, etil acetato y estándares. de Na, Ca, Fe, Zn y Mg se compraron a Merck (Dramstadt, Alemania). El éter dietílico, el éter de petróleo, la acetona, el ácido sulfúrico, el metanol y el acetonitrilo se adquirieron de VWR BDH Prolabo (Radnor, PA, EE. UU.). Catalizador Kjeldahl, solución de hidróxido de sodio para la determinación de azúcares,N , O -bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida y trimetilclorosilano se adquirieron de Supelco (Bellafonte, PA, EE. UU.). d4SA se compraron en CIL (Tewksbury, MA, EE. UU.). Finalmente, se adquirió d3FA de los isótopos CDN (Pointe-Claire, QC, Canadá).

3.3. Análisis aproximado

El contenido de humedad se determinó secando las muestras a 105 ° C durante 6 h. El contenido de cenizas se determinó mediante la incineración de las muestras a 550 ° C durante 6 h. El contenido mineral se determinó por espectrofotometría de absorción atómica. Los métodos de Kjeldahl y Soxlet se utilizaron para determinar el contenido de proteínas y lípidos respectivamente [  ]. El método de Prosky se utilizó para determinar el contenido de fibra soluble e insoluble [  ]. Los contenidos de glucosa, fructosa y sacarosa se determinaron mediante HPLC de intercambio aniónico con detección amperométrica pulsada [ ]. Se extrajo 1 g de muestra con 200 ml de agua destilada y, después de 1 hora a 60ºC, la solución se filtró a través de un filtro Whatman de 0,45 µm. El filtrado se diluyó adecuadamente para reducir la concentración de azúcar dentro de un rango de 0.5 a 5 ppm. Se inyectaron 20 µl de solución de extracto en la columna de HPLC. El sistema de HPLC estaba equipado con un autoinyector LC 717 Plus (Waters, Milford, MA, EE. UU.), Un CarboPac PA1 (4 × 250 mm) y una columna protectora CarboPac PA1 Guard (4 × 50 mm) (Dionex, Sunnyvale, CA, EE. UU.) ), una bomba isocrática Spectra System LC P 1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.) y un detector amperométrico de impulsos ED50 (Dionex, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Se utilizó NaOH 160 mM con un caudal de 1 ml / min como fase móvil. La detección amperométrica pulsada se llevó a cabo con los siguientes potenciales de pulso y duraciones: E OX= +0.6 V (t OX = 430 ms), E DET = +0.1 V (t DET = 400 ms), y E RED = −2.0 V (t RED = 420 ms). Se prepararon soluciones estándar de cada azúcar para abarcar el rango de concentración de 0.5 a 5 ppm. Se inyectaron 20 μL de cada solución de azúcar en el sistema de HPLC para dibujar los valores para la curva de calibración.

3.4. Determinación de β-caroteno

El contenido de β-caroteno se obtuvo con el método descrito por Panfili et al.  ]. Se extrajeron 5 g de muestra con 40 ml de tetrahidrofurano (THF + BHT 1 g / l). La mezcla se agitó vigorosamente durante 15 min. La solución se centrifugó a 400 × g.Durante 1 min y se separó la fase orgánica. La fase residual se extrajo de nuevo con tetrahidrofurano. Las dos fases orgánicas se combinaron en un embudo de separación y se agregaron 40 ml de diclorometano y 40 ml de solución de cloruro de sodio para purificar la solución. La solución se evaporó en un rotavapor a 35 ° C y se reconstituyó con una mezcla de metanol y tetrahidrofurano (MetOH / THF 95: 5). Se filtró en un filtro Whatman (PTFE, porosidad de 0,45 µM) y se inyectaron 20 µl en el sistema de HPLC. El sistema de HPLC se equipó con la columna vydac 201TP54 (Alltech Italia Srl, Milán, Italia), una bomba binaria LC 1525 (Waters, Milford, MA, EE. UU.) Y un detector de matriz de fotodiodos 2996 (Waters, Milford, MA, EE. UU.). La fase móvil fue una solución de acetonitrilo, metanol y diclorometano (84% / 15% / 1% vv ) con un caudal de 1.2 mL / min. La detección espectrofotométrica se realizó a 450 nm. Se prepararon soluciones estándar de β-caroteno para abarcar el rango de concentración de 0.5 a 5 μg / ml. Para cada solución estándar, se usó la absorbancia determinada a 450 nm para dibujar la curva de calibración.

3.5. Determinación de los fitatos

El contenido de fitatos se determinó con el método de Vaintraub y Lapteva [  ] con la modificación propuesta por Gao et al.  ] Brevemente, se agitaron 0,5 g de muestra en 10 ml de HCl al 2,4% durante la noche. Los contenidos se centrifugaron a 1000 xg durante 20 min a 10ºC. El sobrenadante se recuperó y se añadió a 1 x g de NaCl. Los contenidos se agitaron a 350 rpm durante 20 minutos para disolver la sal y se dejaron sedimentar a -20 ° C durante 20 minutos. Las mezclas se centrifugaron a 1000 xg a 10ºC durante 20 minutos y se recogió el sobrenadante transparente. 60 l del sobrenadante claro se agitó con 1440 l de H 2 O. 500! L de reactivo de Wade modificada (0,03% FeCl 3 ∙ 6HSe añadieron 2 O + ácido sulfosalicílico al 0,3%) a la muestra, se mezclaron a fondo en un vórtice y se centrifugaron a 1000 xg a 10 ° C durante 10 min. Se transfirió 1 ml de solución en una cubeta y se midió la absorbancia a 500 nm con un espectrofotómetro Cary 5E (Varian, Palo Alto, CA, EE. UU.). Una serie de patrones de calibración que contenían 0, 0.015, 0.045, 0.09, 0.15 y 0.3 g / L de PA-P se prepararon a partir de fitato de sodio, cuyo contenido de P se estableció como 18.38%. El cálculo del contenido de muestra de PA-P siguió el método descrito en Latta y Eskin [  ].

3.6. Determinación de TEAC

Las capacidades antioxidantes totales se midieron con el método de Serpen [  ]. La solución de ABTS se preparó disolviendo 38,4 mg de ABTS en 5 ml de agua desionizada y la solución de persulfato de potasio disolviendo 6,6 mg de persulfato de potasio en 5 ml de agua desionizada. Se obtuvo un total de 10 ml de regente de radicales ABTS (ABTS ● + ) mezclando las dos soluciones. ABTS ● + se mantuvo en un lugar oscuro a temperatura ambiente durante 12 h. Después de este tiempo, se diluyeron 10 ml de solución ABTS ● + en 800 ml de agua / etanol (50:50 v / v ) para obtener una solución estándar de trabajo de ABTS ● + con una absorbancia de 0.75–0.80 a 734 Nuevo Méjico. Se añadieron 5 mg de muestra a 100 ml de ABTS.● + solución de trabajo. El tubo se agitó en vórtex durante 2 minutos y se colocó en un agitador orbital a 400 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de este tiempo, el tubo se centrifugó durante 2 minutos a 9200 × g , el sobrenadante se recogió y se dejó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se transfirieron 2 ml de sobrenadante a una cubeta y se midió la absorbancia a 734 nm mediante el espectrofotómetro Cary 5E (Varian, Palo Alto, CA, EE. UU.). Se calculó el porcentaje de inhibición de la muestra. Trolox se utilizó como referencia y se prepararon soluciones estándar para abarcar el rango de 0 a 600 μg / ml. Se añadió 0,1 ml de cada solución de trolox a 9,9 ml de ABTS ● +y, después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a 734 nm. Para cada solución estándar, se calculó el porcentaje de inhibición de trolox y se obtuvo la curva de calibración para ABTS. TEAC se expresó como µmol Trolox equivalente / g de muestra.

3.7. Determinación de los fenoles totales

El contenido fenólico total se determinó con el método de Folin-Ciocalteu [  ] en extractos obtenidos de acuerdo con las instrucciones reportadas por Naczk y Shahidi [ ]. Se añadieron 0,5 g de hojas de Moringa a 10 ml de metanol acuoso (80%) y se colocaron en un baño agitado durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la fase de extracción, se agregaron 2,5 ml de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido previamente (1:10) y 2,0 ml de solución de carbonato de sodio a 0,5 ml de extracto metanólico. La solución obtenida se colocó en un baño de agua durante 5 minutos a 50 ° C y posteriormente se enfrió con hielo. Se transfirieron 0,1 ml de solución a una cubeta y se midió la absorbancia a 760 nm con un espectrofotómetro Cary 5E (Varian, Palo Alto, CA, EE. UU.). Se usó ácido gálico como referencia y se prepararon soluciones estándar para abarcar el rango de concentración de 0 a 50 μg / ml. Para cada solución estándar, se midió la absorbancia a 760 nm y se obtuvo la curva de calibración.

3.8. Extracción y análisis por HPLC de polifenoles.

1 g de hojas secas se sometió a extracción con una secuencia de solventes a polaridad creciente (éter de petróleo 40-60, diclorometano y metanol). La extracción se realizó seis veces para cada disolvente con volúmenes y tiempos iguales (20 ml, 1 h), lo que llevó a tres fracciones orgánicas que contenían lípidos, pigmentos y polifenoles, respectivamente.

La muestra seca obtenida con metanol durante el procedimiento de extracción descrito anteriormente se volvió a disolver en el mismo disolvente, se diluyó en acetonitrilo y luego se inyectó. Los análisis de HPLC se realizaron a temperatura ambiente en una HPLC Jasco equipada con un detector de PDA y una columna Lichrocart ® RP-18 (250 × 4,6 mm, 3 µm, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). La composición del eluyente se varió entre 0.1% de ácido fórmico en agua (A) y acetonitrilo puro (B) y aplicando el siguiente programa de gradiente: 0–2 min B 10%, 2–30 min B 10% –25%, 30–40 min B 25% –30%, 40–45 min. B 30%, 45–47 min. B 30% –10%, a un caudal de 0,6 ml · min −1Los análisis LC-MS se realizaron en un sistema Thermo Finnigan LC-MS, equipado con un detector de PDA y un espectrómetro de masas LCQ Advantage, utilizando las mismas condiciones de columna y gradiente que se informaron anteriormente. Los resultados se reportan como áreas integradas.

3.9. Extracción y determinación de GC-MS de ácidos salicílicos y ferúlicos Contenido

El contenido de ácidos salicílicos y ferúlicos totales se determinó utilizando un método de referencia [  ] con algunas modificaciones [  ]. En resumen, se mezclaron 200 mg de muestra con 5 ml de NaOH 1 M y se dejaron a temperatura ambiente durante la noche. Los extractos se agitaron durante 1 hora y se acidificaron a pH 1-2 con HCl 6 N. Finalmente, se transfirió a un embudo de separación y se extrajo dos veces con 15 ml de acetato de etilo [ ]. Las soluciones orgánicas se filtraron a través de Na 2 SO 4 anhidro.El extracto se diluyó hasta un volumen prefijado en un matraz volumétrico con acetato de etilo. Se añadieron 100 µl de solución de mezcla estándar interna (500 ng / ml) que contenía d4-SA y d3-FA a una parte alícuota de 1 ml del extracto y se secó con una corriente de nitrógeno. Las muestras secas se derivaron añadiendo 50 μl de una solución (1: 1) de acetonitrilo y N , O -bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con 1% de trimetilclorosilano y manteniendo la solución a 70 ° C durante 1 h.

La cuantificación analítica de los ácidos salicílico y ferúlico se realizó mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas por dilución isotópica (GC-MS), mediante un cromatógrafo de gases GC-17A (Shimadzu, Tokio, Japón) que interactúa con un espectrómetro de masas de un solo cuadrupolo. -QP5050 (Shimadzu, Tokio, Japón). La separación por cromatografía de gases se realizó en una columna capilar DB-5-MS (30 m; 0.25 mm id., 0,25 µm de espesor de película) (J&W Scientific, Folsom, CA, EE. UU.). El espectrómetro de masas funcionó en modo de impacto electrónico (70 eV) y el equipo se configuró para llevar a cabo un monitoreo selectivo de iones (SIM). El análisis cualitativo se realizó analizando el rango 50-450 U de estándares individuales. Los espectros de masas de ácidos salicílicos y ferúlicos con estándares internos derivados se muestran en la Figura 2El monitoreo selectivo de iones para cada analito fue 267 m / z para ácido salicílico y 271 m / z para su estándar interno y 323 m / z para ácido ferúlico y 326 para su estándar interno. Las soluciones estándar de ácidos salicílicos y ferúlicos se realizaron en un rango de concentración entre 10 y 100 ng / ml. La identificación del ácido salicílico derivatizado se logró comparando los tiempos de retención cromatográficos de gases y los espectros de masas de los extractos con los de los estándares auténticos. En cada muestra, la cuantificación de los ácidos salicílicos y ferúlicos se realizó utilizando curvas de calibración obtenidas al medir la relación de respuesta de cada derivado a la del estándar interno, y se representaron gráficamente.vs. sus concentraciones conocidas. Las curvas estándar fueron lineales para todos los compuestos individuales en el rango de concentración investigado, con los coeficientes de correlación r > 0.999. Los límites de detección y cuantificación fueron 0.6 y 2 ng para el ácido salicílico y 0.5 y 1.8 ng para el ácido ferúlico.

Un archivo externo que contiene una imagen, una ilustración, etc. El nombre del objeto es ijms-16-18923-g002.jpg

Espectro de masas de salicílico ( A ); ácidos ferúlicos ( B ) con estándares internos.

3.10. Análisis estadístico

Todos los análisis se realizaron con Excel 2007. Los resultados relevantes se presentaron como media ± SD de tres réplicas.

4. Conclusiones

En conclusión, observamos algunas diferencias en términos de nutrientes y compuestos fenólicos en las hojas de M. oleifera cultivadas en diferentes países. Sin embargo, las hojas de M. oleifera son una buena y económica fuente de nutrientes y, por lo tanto, son un complemento alimenticio prometedor para contrastar la desnutrición (especialmente la malnutrición crónica de los niños durante los primeros 1000 días de vida) que es endémica en muchas poblaciones. de zonas tropicales y subtropicales. Además, las hojas de M. oleifera son una fuente de flavonoides y ácidos fenólicos, entre los cuales se encuentran los ácidos salicílico y ferúlico y, por lo tanto, se podrían usar como ingrediente nutracéutico y funcional.

Expresiones de gratitud

“Las muestras de Moringa oleifera de Chad se obtuvieron con el apoyo del Programa de Ciencia y Tecnología ACP (África, el Caribe y el Pacífico), un programa del Grupo de Estados ACP, con la asistencia financiera de la Unión Europea. El contenido de esta publicación es responsabilidad exclusiva de la Universidad de Milán (y ACRA) y en ningún caso debe considerarse que refleja la posición de la Secretaría de la ACP y de la Unión Europea ". Agradecemos a Alberto Spada por su contribución en la identificación de plantas de Moringa oleifera . Este estudio fue apoyado por la subvención interna de ICANS.

Contribuciones de autor

Alessandro Leone, Simona Bertoli, Alberto Schiraldi y Alberto Battezzati concibieron y diseñaron los experimentos; Alessandro Leone, Giovanni Fiorillo, Franca Criscuoli, Stefano Ravasenghi, Laura Santagostini, Gelsomina Fico y Angela Spadafranca realizaron los experimentos; Laura Santagostini y Gelsomina Fico diseñaron, optimizaron, llevaron a cabo análisis y analizaron datos sobre contenido fenólico; Alessandro Leone analizó todos los datos; Federica Pozzi, Sara Di Lello y Sandro Filippini contribuyeron con materiales; Alessandro Leone escribió el papel; y todos los autores aprobaron la versión final del manuscrito.

Conflictos de interés

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Los artículos de International Journal of Molecular Sciences se proporcionan aquí, cortesía del Multidiscipisciplinario de Publicaciones Digitales (MDPI).